1937年“七七”事变后，他同平津流亡学生一起到达济南，在中共山东省委动员青年到鲁西北发动抗日游击战争时，被分配到聊城。这时，韩复榘命令山东第六行政区专员兼保安司令范筑先撤退到黄河以南，于笑虹等几十名青年则反对不战而退。后来，范筑先在共产党的统一战线政策感召下，拒不接受韩复榘的命令，通电全国表示“守土有责，誓不南渡”，于笑虹时任范的卫队长。1938年春，他被派往寿张，发动群众开展抗日救亡运动，建立抗日武装。是年7月，他加入中国共产党，到范筑先部第二十一支队任政治部主任，从事争取改造该部队工作。1939年春，于笑虹遵照党的指示，到临清组建卫河支队，先后任该支队副司令、司令。1940年春，调八路军一二九师先遣纵队一团任团长。10月，调任一二九师新八旅二十二团政委。
二十二团作为新八旅的主力团，转战邯郸南北的平汉铁路沿线和临清、大名间的卫河两岸，多次给日军以重创。1942年，日军对冀南抗日根据地频繁进行“扫荡”，于笑虹在反“扫荡”中，机智地带领部队英勇战斗。1月24日，2000多日伪军配以坦克、汽车，对活动在曲周、邱县、广平、馆陶交界的新八旅进行“合围”，二十二团正处在敌人合围的中心。于笑虹指挥部队，英勇地向日伪军进行冲杀，在西张孟、崔庄、侯村、东阳固等地，多次展开激战，胜利地突破了敌人的包围。1943年，他带领二十二团开辟卫河以东地区，不久，任冀南七分区政治部主任。抗日战争的8年间，他转战卫河两岸，屡建战功。
解放战争时期，于笑虹先后担任晋冀鲁豫野战军第二纵队第六旅政治部主任、第二野战军第十军第二十八师政委、第二十九师政委等职，曾转战冀鲁豫，强渡黄河，挺进大别山，参加过淮海战役、渡江战役和解放大西南的战斗。
新中国建立后，于笑虹任海军修造部、工程部政委，1956年任海军第二海校校长兼政委，1958年任海军科研部部长，受命领导海军装备事业的科研工作。他走访了全国十多所重点院校和科研单位，吸收了几百名大专毕业生和专业人员，先后组织建立了6个研究所，召开了第一次全国性的舰船科研协调会议，把全国造船科研力量组织起来，为发展海军装备服务。1960年，他又和战友刘华清、戴润生一起，按照中央军委的指示，克服种种困难，组建了一个研究院，并在较短的时间里，完成了舰艇流体和结构力学、动力设备及工艺材料等科研项目的试验，为我国舰船科研事业的发展打下了良好基础。1961年调国防部第七研究院任副院长、院长，晋为少将。1963年，于笑虹在第一次科技工作会议上，明确阐述了自己的观点：“科学技术现代化是国防现代化的关键，为实现国防现代化，许多科学技术问题要解决。当前需要科学技术现代化的迫切程度，如同大革命时期需要人民武装一样。”对重大科研项目和重大措施，他总是亲自调查研究，广泛听取专家和群众意见，看准了的，就一抓到底，抓出成效。“文化大革命”期间，王洪文、张春桥等人捏造罪名，对于笑虹进行了五六年的审查和批判，面对“四人帮”的迫害，他坚持斗争。1971年，于笑虹任第三研究院院长，他写信给周总理和中央军委副主席叶剑英，汇报知识分子的不幸遭遇，再一次受到“四人帮”的残酷迫害，他气愤难平，心脏病突然发作，于1973年6月含冤逝世。1980年，于笑虹蒙受的不白之冤得到平反昭雪，被授予烈士称号。5月22日，在海军远洋测量船队的指挥船上，于笑虹的老战友遵照他的遗嘱，将他的骨灰撒放在大洋之中。
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